人主动脉平滑肌细胞

人主动脉平滑肌细胞发送复苏存活细胞方式：

（1）存活细胞，收到后应继续生长，传代达到细胞生长状态良好时。具体操作见细胞培养步骤。

（2）收到细胞后请拍照，3天内如果发现污染，请及时拍照与我们沟通。


人主动脉平滑肌细胞接受后的处理：

1） 收到细胞后，请检查是否漏液，如果漏液，请拍照片发给我们。

2） 请先在显微镜下确认细胞生长状态，去掉封口膜并将T25瓶置于37℃培养约2-3h。

3） 把T25瓶中的培养基到出，留6ml完全培养基，每天换液一次。

4） 如果细胞长满（90%以上）请及时进行细胞传代。

5） 接到细胞次日，请检查细胞是否污染，若发现污染或疑似污染，请及时与我们取得联系。
         
细胞培养步骤
一．培养基及培养冻存条件准备：

1） 准备基础培养基100%；北美胎牛血清5%，添加剂1%；双抗1%。

2） 培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

二． 细胞处理：

1） 复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2） 细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1）选用原代细胞生长状态好（90－95％），生长数量大于5×105进行传代。

2）吸除原代细胞培养液。用含双抗的1×PBS（pH7.4）清洗细胞培养瓶2次。

3）3ml细胞消化液加入细胞培养瓶，轻轻摇动，使细胞消化液覆细胞培养瓶底。

注：推荐客户用钬飞生物原代细胞消化液。

4）细胞培养瓶置于5%CO2、95%空气、37oC培养箱静置培养2分钟后，在显微镜下观察原代细胞的消化状态。

请记住：如贴壁细胞逐渐趋于圆形、部分悬浮后，用手指轻轻拍打细胞培养侧部至大部分贴壁细胞悬浮，加入3ml血清终止液，终止细胞消化。每种原代细胞的消化时间是有差异的。

5）吹打培养瓶中悬浮细胞若干次，再吸出细胞悬浮液，转入15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。注：推荐客户用钬飞生物原代细胞培养体系。

6）弃离心管中液体，加入原代细胞培养液重悬细胞。细胞计数，确定细胞数量。

7）细胞分瓶后，加入适量原代细胞培养液至细胞培养瓶中，置于5%CO2、95%空气、37oC培养箱静置培养24小时。

下面T25瓶为类；

1，细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2，4min 1000rpm 离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

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